على نمو مجموعة من الفطريات

د ارسة تأثير بكتريا Rhizobium leguminosarum bv. Viciae 1 كلية علوم البيئة وتقاناتها جامعة الموصل الموصل الع ارق 2 قسم علوم الحياة كلية العلوم جامعة الموصل الموصل الع ارق الملخص على نمو مجموعة من الفطريات 2 1 محمد اب ارهيم الطائي زكريا سامي المولى ( تاريخ االستالم: 22/ 3 / 3 تاريخ القبول: ) 22 / 12 / 11 تم في هذا البحث د ارسة تأثير بكتريا Rhizobium leguminosarum bv. Viciae على نمو ( 2 ) انواع من الفطريات بطريقة التضاد الحياتي. اظهرت البكتريا تأثي ار تثبيطيا بنسبة % 1 ل) 6 ( أنواع من الفطريات المدروسة وهي sp. Alternaria alternata, Penicillium sp., Fusarium Helminthosporium sp., Nigrospora sp. في حين ابدى الفطر Stemphylium sp. و sp. Cladosporium مقاومة لتاثير البكتريا حيث بلغت نسبة التثبيط وبنسبة تثبيط % 2.48 بالنسبة لنمو فطر Aspergillus fumigatus 2242 % فقط. ان التأثير التثبيطي لبكتريا R. leguminosarum bv. Viciae قد يعود الى قدرتها على مقاومة العديد من المضادات الحيوية الحتوائها على انزيمات البيتا الكتاميز وايضا اف ارزها لمواد سامة لها تاثير تثبيطي على نمو االحياء المجهرية. المقدمة ان االحياء المجهرية التي تنمو في منطقة ال اريزوسفير Rhizosphere ممكن ان يكون لها دور كبير في عمليات التضاد الحياتي حيث توفر منطقة ال اريزوسفير خط الدفاع االولي للجذور ضد تاثي ارت االحياء المجهرية الممرضة )1(. من بين االحياء المجهرية التي تعيش في منطقة ال اريزوسفير والتي تعد من االحياء المهمة جدا في حياة النبات هي بكتريا Rhizobium leguminosarum bv.viciae حيث تقوم هذه البكتريا بعملية تثبيت النتروجين الجوي في التربة وتعد هذه العملية اساسا في توفير النتروجين في التربة وللنبات )2(. ان منطقة ال اريزوسفير عبارة عن منطقة غنية جدا بالمواد العضوية وتكون مفعمة بالنشاط البكتيري نظ ار لوجود الجذور النباتية التي بدورها تقوم بعمليات االمتصاص والخزن في بعض النباتات حيث توفر بيئة مالئمة لنمو وتواجد العديد من االحياء المجهرية النافعة والممرضة ان هذا التواجد يخلق نوعا من التنافس بين هذه الكائنات على المواد الغذائية والتي تحاول بما تمتلك من مواد ايضية وانزيمات ان تثبط أوتقضي على نمو االحياء االخرى باليات معينة حسب امكانيات كل كائن مجهري )3(. تشير العديد من البحوث الى ان بكترياbv.viciae.R leguminosarum لها القدرة على مقاومة العديد من المضادات الحيوية التي هي عبارة عن مواد تنتج من قبل االحياء المجهرية وهذا يدل على امتالكها ا ليات معينة لمقاومة او تحليل هذه المركبات وهذا يمكنها من النمو وعدم التاثر بالمواد المفرزة من قبل هذه االحياء في منطقة ال اريزوسفير وهذا يمثل الوسيلة االولى من وسائل التنافس ).(. يهدف البحث الى د ارسة تأثير بكتريا.R leguminosarum bv.viciae على نمو عدة انواع من الفطريات ( والتي تمثل الوسيلة الثانية من وسائل التنافس ) والتي قد تتواجد في منطقة ال اريزوسفير وخاصة عند جذور النباتات البقولية والتي قد تؤثر سلبا على نمو النبات ونشاطه حيث ان العديد من الفطريات تكون ممرضة للنبات. 2

المواد وطرق العمل عزلة Rhizobium leguminosarum bv.viciae بكتريا تم عزل R. leguminosarum bv.viciae من جذور نبات الباقالء باستخدام وسط اكار سكر المانتول ومستخلص الخميرة Manitol نبات (MYA) Yeast Extract Agar حيث تم اختيار عدة عقد جذرية من الباقالء وتم تعقيمها سطحيا باستخدام الكحول االثيلي بعدها غسلت العقد الجذرية بماء مقطر ومعقم ال ازلة تأثير الكحول ومن ثم سحقت بواسطة ابرة معقمة نقلت بعدها باستخدام لوب معقم الى وسط (MYA) وزرعت بواسطة التخطيط حظنت االطباق عند درجة ح اررة 21 1-3 أيام ).( العزالت الفطرية م لمدة استخدمت العزالت الفطرية التالية في البحث Alternaria alternate, Aspergillus fumigatus, penicillium sp., Fusarium sp., Stemphylium sp. Helminthosporium Cladosporium sp. و sp. Nigrospora sp. تم عزل فطر A. alternata من او ارق الباقالء المصابة حيث اخذت الورقة المصابة وبعد تعقيمها سطحيا بالكحول زرعت على وسط اكار مستخلص البطاطا والسكروز في اطباق بتري قطر و Potato sucrose agar extract (PSA) 1 سم وبعد 2 ايام من التحضين نقيت العزلة وشخصت باالعتماد على المفاتيح التصنيفية التالية )1 6(. تم عزل كل من الفطريات sp. Fusarium و. Helminthosporium sp Nigrospora من التربة بطريقة التخافيف حيث اخذ وزن معين من التربة ) 1 (غم واضيف الى 8 مل ماء مقطر ومعقم مع الرج ثم اخذ 1 مل من التخفيف واضيف الى 8 مل ماء مقطر ومعقم مع الرج بعدها تم بعدها سكب وسط (PSA) فوق التخفيف مع التحريك على شكل رقم 8 وبمعدل) 3 ( مكر ارت حضنت االطباق عند درجة ح اررة 22 م لمدة 2-1 ايام ثم اختيرت االجناس االكثر شيوعا في االطباق ) 2 (.اما بقية العزالت الفطرية فتم الحصول عليها من مختتب ارلفطريات في قسم علوم الحياة كلية العلوم جامعة الموصل. تاثير بكتريا Rhizobium leguminosarum bv.viciae على نمو الفطريات : تم عمل معلق بكتيري لبكتريا.R leguminosarum bv.viciae وذلك بتحضير المرق المغذي Nutrient broth في قنينة زجاجية وبعد تعقيمها لقحت ببكتريا.R leguminosarum bv.viciae وحضنت عند درجة ح اررة 22 م لمدة.2 ساعة حيث ظهر النمو بشكل عكورة داخل القنينة بعدها تم تلقيح اطباق بتري حاوية على وسط PSA تركت لمدة 11 دقيقة لغرض تشرب البكتريا داخل الوسط )2( وتم اختبار االطباق الحاوية على البكتريا بالفطريات وذلك باخذ اق ارص من حواف المستعمرة الفطرية النامية بواسطة ثاقبة فلين قطر 41 سم ووضعت اق ارص الفطريات في وسط كل طبق وبمعدل ثالث مكر ارت لكل فطر مع تلقيح اطباق اخرى باالق ارص الفطرية تحوي نفس الوسط غير ملقحة بالبكتريا لغرض المقارنة وبنفس عدد المكر ارت. حضنت االطباق عند درجة ح اررة ± 21 3 م لمدة 1 ايام بعد انتهاء فترة التحضين تم قياس قطر كل مستعمرة فطرية ومقارنتها مع وتسجيل النتائج )1( و) 2 (. النتائج والمناقشة اوضحت نتيجة االختبار تأثير بكتريا.R leguminosarum على الفطريات وكما هو موضح في الجدول: ز ارعة 1 مل من هذا التخفيف في طبق بتري ثم صب في طبق بتري الجدول )1( يوضح اقطار المستع ارت الفطرية النامية مع بكتريا.R leguminosarum معدل قطر معدل قطر المستعمرة الفطر المستعمرة الفطرية النامية الفطرية النامية بدون بكتريا مع البكتريا سم سم ( ( 7.6 7.6 5.8 6.6 2.2 1.1 1.7 Aspergillus fumigatus Fusarium sp. Alternaria alternate Cladosporium sp. Stemphyilum sp. 146 Helimenthosporium sp. 643 Nigrospora sp. 2

243 42 Penicillium sp. ان هذه النتائج تشير الى ان بكتريا.R leguminosarum عملت على تثبيط نمو معظم الفطريات قيد الد ارسة وبشكل كبيرة مقارنة بمعاملة السيطرة. حيث عملت البكتريا على تثبيط نمو فطر Aspergillus fumigatus وبنسبة 1% مقارنة بمعدل نمو كما هو موضح بالشكل )1 ( نمو الفطر مع البكنريا الشكل )1( توضح تاثير بكتريا.R leguminosarum على نمو فطر Aspergillus fumigatus حيث توضح الشكل تأثير بكتريا.R leguminosarum الواضح على نمو فطر.A fumigatus اذ بلغ معدل قطر مستعمرة الفطر في معاملة السيطرة 243 سم بينما كان معدل نمو قطر مستعمرة الفطر تحت تاثير البكتريا 141 سم حيث بلغت نسبة التثبيط %. 2.48 اما بالنسبة لفطر.A alternata فان معدل قطر مستعمرة الفطر النامية الشكل )3( توضح تاثير بكتريا.R leguminosarum على نمو فطر Cladosporium sp. تميز الفطر. sp Stemphelum بالقدرة على النمو وعدم التاثر بنمو بكتريا.R leguminosarum نسبيا حيث بلغ معدل نمو الفطر في معاملة السيطرة 242 سم في حين بلغ معدل النمو تحث تاثير البكتريا 142 سم بنسبة تثبيط % 2242 فقط وهذا يعطي احتمال قدرة هذا الفطر على مقاومة االنزيمات المحللة التي تفرزها هذه البكتريا باالضافة الى اليات فسلجية اخرى.وكما هو موضح في الشكل ).(. في كانت 142 سم في حين بلغ معدل نمو الفطر تحت 1 تاثير البكتريا سم بنسبة تثبيط % وكما هو موضح في الشكل.)2(.R leguminosarum على نمو فطر الشكل )2( توضح تأثير بكتريا.R leguminosarum على نمو الشكل )4( توضح تاثير بكتريا sp. Stemphylium مقارنة ب. الفطرalternata.A R. كذلك اظهر الفطر sp. Cladosporium حساسية كبيرة تجاه بكتريا leguminosarum حيث بلغ معدل نمو الفطر في الطبق المعد للمقارنة 646 سم في حين بلغ معدل النمو تحت تاثير نمو البكتريا سم بنسبة تثبيط % 1 وكما موضح في الشكل )3(. اما بالنسبة لفطر sp. Penicillium فقد اظهر تاث ار كبي ار بالبكتريا اذ عملت البكتريا على تثبيط نموه بالكامل تقريبا حيث بلغ معدل نمو الفطر

في 243 سم في حين بلغ معدل الشكل )7( توضح تأثير البكتريا على نمو كل من 42 سم بنسبة تثبيط % 8243 وكما هو موضح في الشكل )1(. الفطرين sp. Helimethosporium و الفطر. sp Nigrospora ان بكتريا R. leguminosarum bv.viciae هي احدى االحياء المجهرية النامية في منطقة ال Rhizosphere والتي تكون ذات فعالية حيوية نشطة نظ ار لما تحتويه من مواد عضوية ونواتج ايضية واف ار ازت حيوية من قبل جذور النباتات. ان تواجد اعداد هائلة من االحياء المجهرية في هذه المنطقة يخلق نوعا من التنافس وا ليات التضاد بين االحياء المجهرية للحفاظ على النوع والقدرة على التغذية واالستم ارر بالنمو. تعد بكتريا ال اريزوسفير من اكثر االحياء المجهرية قدرة على المقاومة وتحمل الظروف غير الطبيعية ومن هذه االحياء بكتريا.R حيث اشار الحسو والطائي ).( الى ان بكتريا R.leguminosarum leguminosarum لها القدرة على مقاومة العديد من المضادات الحيوية حيث ذك ار ان هذه البكتريا استطاعت مقاومة )11( نوع من المضادات الحيوية من اصل.1 نوع وهذا يدل على ان هذه البكتريا تمتلك اليات معينةتمكنها من ا ازلة تاثير هذه المضادات. وهذا ما اشار اليه )8( من ان بكتريا.R leguminosarum تمتلك الشكل )5( توضح تاثير بكتريا.R leguminosarum على نمو فطر sp. Penecillum ابدى الفطر sp. Fusarium حساسية كبيرة تجاه البكتريا حيث عملت على اخت ازل نمو بالكامل حيث بلغ معدل نمو الفطر في معاملة السطرة 246 سم في حين بلغ معدل سم بنسبة تثبيط % 1 وكما هو موضح في الشكل )6(. انزيمات البيتا الكتاميز وانها على االكثر تستخدمها في مقاومة مضادات البيتا الكتام وايضا تمتلك االنزيمات واسعة الطيف التي تحلل سيفالوسبورينات الجيل الثالث من المضادات المهمة عالجيا. ان امتالك هذه البكتريا النزيمات البيتا الكتاميز وباكثر من نوع يفسر سبب مقاومتها للعديد من مضادات البيتا الكتام والتي معضمها هي عبارة عن مواد تفرزها االحياء المجهرية وبضمنها الفطريات كا ليات للدفاع عن نفسها في البيئة التي تعيش فيها) 1 (. الشكل )6( تاثير بكتريا.R leguminosarum على نمو الفطر Fuzarium sp. كذلك عملت البكتريا على تثبيط نمو كل من الفطرين sp. Nigrospora Helimenthosporium sp. 1 وبنسبة % وبغت معملة السيطرة لكل منهما 146 سم و 643 سم على التوالي وكما موضح بالصور )6(. باالضافة الى ماذكره )11( من ان بكتريا R.legminosaruim تفرز مواد ايضية سامة لها تاثير تثبيطي على االحياء المجهرية الممرضة للنبات. واشار )12( ان بكتريا R.legminosaruim تفرز مضادات حيوية لها القدرة على تحليل هايفات الفطريات.كما ذكر )13( من ان بكتريا R.legminosaruim لها القدرة على تثبيط نمو العديد من الفطريات عن طريق اف ارز مواد طيارة من ظمنها غاز ال Cyanide السام حيث تمتلك بكتريا R.legminosaruim عدة اليات تمكنها من السيطرة على الممرضات والتي تتضمن المنافسة على الحديد والمغذيات واف ارز المضادات. ان سبب تثبيط نمو الفطريات يعود الى اف ارز المواد االيضية في الوسط الغذائي والتي قد تتضمن مضادات حيوية وانزيمات محللة للجدار الخلوي. (3) Ozkoc, Ibrahi and Deliveli, Muhammet (21). Invitro inhibition of mycelial growth of some root rut Fungi by Rhizobium leguminosarum Biovar phaseoli isolates Ondokuzmayis University. faculty of Arts and Science. Department of biology. 55139.kurupelit.Turky. المصادر (1) Sharif, Tabssam ; Khalil, Samina and Ahmad, Shahhaz (23). Effect of Rhizobium sp. on Growth of pathogenic Fung under invitro condition. Pakistan Journl of Biolgy Science. 6(18): 1597-1599. )2( قاسم غياث محمد وعلي مضر عبد الستار )1989(. علم احياء التربة المجهرية و ازرة التعليم العالي والبحث العلمي جامعة الموصل. 2

).( الحسو محمود زكي والطائي محمد اب ارهيم )27(. تقدير حساسية بكتريا Rhizobium leguminosarum bv. Viciae لبعض مضادات البيتا الكتام مجلة التربية والعلم كلية التربية جامعة الموصل. (5) Moubasher, A.H.(1993). Soil fungi in Qatar an other Arab countries. The scientific and Applied research center. University of Qatar. (6) Pitt, J.T. and hocking, A.D. (1997). Fungi and Food spoilage. Academic Press london, 45pp. (7) Clark, F.E.(1979). Agar plate method for total microbial count in method in soil analysis. Ayron Pp(146-1466), Madison, Wisconsin., U.S.A. (8) Roland, M.A. and Alfred, E.B.(1995). Laboratory Manual of experimental microbiology. moby-year book, Inv., U.S.A. )8( الطائي محمد اب ارهيم والحسو محمود زكي )27(. التحري عن بعض انزيمات البيتا الكتاميز في جرثومة مجلة التربية والعلم كلية التربية leguminosarum bv.viciae جامعة الموصل. (1) Livermore, D.M. and Brown, D.F.(21). Detection of β-lactamase mediated resistance. J. Antimicrob. Chemother., 28(supp.S1): 59-64. (11) Chakayabotry, U. and Purkayastha, R.P. (1984). Role of Rhizobitoxine in protecting Soyabean roots for Macrophomina Phaseolina infection. Gam. J. microbial., 3: 295-289. (12) Malajezuk, N.(1983). Microbial antagonism to phytopathora Amer. Phytopha. Soc.st.Paul, Minnesota, U.S.A. (13) Arfaoui, A.;Sifi, B.; Boudabous, A.; Elhadrami, I. and Cherif, M.(26). Identification of Rhizobium isolates Possessing antagonistic activity against Fusarium oxysporum F.S.P. ciceris, the causal agent of Fusarium wilt of chickpea. Journal of plant pathology, 88(1), 67-75. Rhizobium 2

ISSN:1813 1662 مجلة تكريت للعلوم الصرفة مجلد 21 عدد )2 ) 222 Effect study of Rhizobium leguminosarum bv. Viciae on some fungi group growth Mohammad I. Altaee 1, Zakaria 2 S. Almolla 2 1 Environ. Sci. and technology, Mosul University, Mosul, Iraq 2 Bio. Dep., College Sci. College, Mosul University, Mosul, Iraq (Received 3 / 3 / 28, Accepted 15 / 12 / 28) Abstract In this research we studied the effect of Rhizobium leguminosarum bv. Viciae on (8) isolates fungi growth by using antagonistic method, the bacteria showed inhibitory effect in ratio 1 % to (6) isolates namely Alternaria alternata, Penicillium sp., Fusarium sp. Helminthosporium sp., Nigrospora sp. and Cladosporium sp. and inhibit the growth of Aspergillus fumigatus fungi in ratio 84.9 %. while the isolate Stemphylium sp. showed resistance to R. leguminosarum bv. Viciae with ratio 22.7 %. The inhibitory effect of R. leguminosarum bv. Viciae may be attribute to the ability of this bacteria to resist many antibiotic by releasing β-lactamase enzyme and toxic compound that inhibit fungi growth. 1